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第一日(12-03) 第二部分


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2021年遗传学专题研讨会将大数据挖掘的研究成果与富有经验的临床医生的敏锐观察结果进行比较,讨论了健康数据分析在遗传性癫痫研究发展中的前景和局限性,回顾了临床观察在遗传性癫痫研究发展中的作用,探讨了如何提高数据分析能力以提供有意义的结果。来自哥伦比亚大学欧文医学中心的Tristan T. Sands主持了此专题研讨会,来自纽约威尔康奈尔医学院的Zachary M. Grinspan博士和来自比利时鲁汶大学的 Maria Roberta Cilio 博士进行了专题汇报。

Zachary M. Grinspan博士认为大数据挖掘对癫痫研究大有裨益。他指出,通过数据挖掘,研究者可以从临床和管理机构的数据集中获取某一癫痫群体患者的临床、流行病学信息,进行卫生服务、成本效益分析研究,为临床试验、提高医疗水平打基础。Zachary M. Grinspan博士也介绍了从临床记录中获取患者表型信息的方法,包括应用文本处理/自然语言处理、图表提取等方法处理临床叙述等非结构化文本,通过医学常见数据元素处理临床格式化文本(结构化字段),通过可计算处理的表型信息处理管理机构数据(结构化字段),并通过“机器学习帮助识别适合外科手术的癫痫患者”、“对非结构化的医学记录进行自然语言处理帮助提高Dravet综合征患者的早期诊断”等相关文献具体讲解了大数据分析在癫痫诊治中的应用(详见参考文献1-10)。

不同于Zachary M. Grinspan,Maria Roberta Cilio 博士更强调了敏锐的临床观察在癫痫诊治中的价值。她认为大数据挖掘存在陷阱。相对于基因组大数据,临床信息相对缺乏,而且从大数据集中获得的临床数据质量也难以保证,多数临床记录中的描述不够精确,导致可能出现 “表型化差距(phenotyping gap)”。而对癫痫的术语、诊断、治疗的不恰当概括是癫痫患者管理不当最重要的因素。她以Dravet综合征、KCNQ2-DEE为例,结合相关文献证明大数据分析可能得出错误的结论(参考文献11-14)。最后,她指出,1)在面对大数据结果时需要从临床专家角度进行批判性解读;2)在学习及教学过程中要重视专业术语和表型描述,因为这些信息最后都可能成为大数据分析的内容;3)要善于从单个患者身上学习,积累临床经验,成为敏锐的临床观察者;4)临床直觉可能有助于我们对常见和罕见的癫痫疾病做出更正确、高级的诊断。

 

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过去十年中,干细胞分化成自组装的3D结构(脑类器官)已经取得了巨大进展,脑类器官再现了发育中人脑的许多特征。脑类器官正在成为一种强有力的实验工具,用于模拟包括癫痫在内的神经系统疾病。本研讨会讨论了干细胞衍生人脑类器官技术的研究现状,重点介绍了此技术在癫痫研究中的应用。本场会议的主席为Chris Makinson博士,共三位讲者分别进行分享。

会议主席Chris Makinson主要介绍了脑类器官如何用作建立癫痫模型,以及其优缺点,并对未来该领域新技术进行了展望。Chris Makinson指出:根据我们追踪长期培养的脑类器官的转录组变化发现长期培养的脑类器官中的关键因子和人脑变化较一致(并举例比较了GRIN2A、GRIN2B在脑类器官300天和胚胎脑7-8月的动态变化一致性,见图11)。但如何使用脑类器官来研究癫痫成为问题关键。并举例了不同的脑类器官模型可用来研究不同癫痫的异常神经环路。最后他还指出了脑类器官目前的局限性:1.即使长期培育,依然处于不成熟的发育状态;2.缺乏远距离的神经投射和连接;3.转录组分析发现异常无法归类的神经元(Frankencells)种类和炎症应激因子的升高;4.和人脑以及小鼠大脑相比,分层不明晰,区域不明晰;5.长时间培养,时间成本及经济成本均较高;6病人和病人之间生成的脑类器官异质性较大(解决方法:通过基因编辑构建病人自己细胞作为对照isogenic line)。

图1.GRIN2A、GRIN2B在脑类器官300天和胚胎脑7-8月的动态变化一致性1

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Giorgia Quadrato主要介绍了其实验室如何通过将新兴的脑类器官模型与单细胞转录组学方法相结合,用以探究人脑发育和神经精神类疾病的细胞和分子基础。Quadrato课题组发现虽然不同脑类器官的组成细胞差异较大,但很多人类前脑的神经元在脑类器官中被发现。并且,自闭症相关风险基因大多聚集在前脑。最近该实验室旨在开发层次结构清晰的不同脑区的定向分化的大脑类器官,建立可产生有功能的长程神经元投射的大脑类器官。Quadrato还指出在制备脑类器官的时候要注意脑类器官之间的异质性,同一批、相同大小、单个类脑才可以做比较。且如果研究Wnt等会受定向分化脑类器官培养方案干扰的通路,最好使用非定向的脑类器官方案,以免培养方案干扰致病通路。

Alex Shcheglovitov主要介绍了其实验室正在进行研发的一种新型脑类器官培养方法—单神经花环(single neural rosette,SNR)脑类器官培养法。他指出因目前的自组装非定向脑类器官具有很大的异质性,这种变异将会影响实验结论的准确性。因此,该课题组开发了一种SNR脑类器官培养方法,培养出来的脑类器官异质性较低,用单细胞转录组测序对SNR脑类器官进行分析,发现有很高的同质性。通过对其细胞的区域特性进行分析显示SNR脑类器主要表达端脑的神经标志物。通过对其神经元和神经网络的功能进行分析,发现SNR脑类器官的单个神经元放电模式与神经元成熟程度和神经元类型相关,通过染色能看到轴突和树突棘。并对6月大的SNR脑类器官行16电极多通道放电实验测试其神经网络功能。(Shcheglovitov表示相关实验流程和数据结论参会者可自行登陆http://organoid.chpc.utah.edu/查看)

 

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2021年专题研讨会探讨了CRISPR在癫痫治疗中的潜力,主要包括了解CRISPR 基因组工作机制、衍生工具及其各种应用,回顾了CRISPR面临的挑战并展望了其今后应用于临床的意义。会议由José Ángel Aibar主持,有三位讲者进行了专题汇报。

Aguan D. Wei首先介绍了KCNQ家族, KCNQ基因可累及神经元、上皮细胞转运或心肌等。KCNQ5编码神经元或平滑肌的阈下K+离子通道/M电流,在CA3区和皮质表层表达富集。临床全外显子测序揭示KCNQ5新发突变可能与癫痫和智力障碍相关。既往报道的无义或错义突变分布在通道亚基各个区域。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过靶向小鼠干细胞的kcnq5基因,能够产生具有两种部分序列敲除的基因,模拟功能丧失(LOF)突变,突变的老鼠显示晚发型的癫痫发作,EEG在安静时/非快速动眼睡眠期显示癫痫样放电,并具有与SCN1A杂合缺失相似的热敏感性发作,能够为基于神经环路和细胞水平的在体功能障碍提供研究。KCNQ5错义突变在HEK293细胞中通过改变通道的电压依赖性激活或门控动力性失活机制从而导致功能获得(GOF),但KCNQ5无义突变(R178X)和KCNQ5(R443X)为LOF突变,其致病原因可能是突变后蛋白无法运输至细胞膜。猜测KCNQ5能够通过影响中间神经元从而产生类似于Dravet综合征的表现。

Gaia Colasante紧接着介绍了Dravet综合征(DS),其能够导致明显升高的猝死风险,约80%的Dravet综合征病人都是由SCN1A杂合突变引起。SCN1A编码的Nav1.1主要在GABA 能中间神经元(PV-INs)的轴突起始段(AIS)表达,能够促进神经元兴奋,同时也在表达生长抑素的树突(SST-INs)中稀疏表达,且是这些细胞中动作电位 (AP) 生成的主要决定因素。Scn1a敲除的小鼠模型表现出自发的癫痫发作和行为学改变。SCN1A突变导致的Dravet综合征主要机制为单倍体不足,可利用活化的CRISPR调控正常链的启动子来促进正常链的表达。Cas9作为一种核酸酶,其RuvC 和 HNH 结构域中的 D10A 和 H840A 突变后能够消除Cas9的切割作用但不会损害其靶向作用,从而产生dCas9(dead-Cas9)。在CRISPR激活系统中,dCas9 可与多个VP16转录激活子域融合来促进基因转录。Gaia团队利用dCas9系统在 DS的细胞和动物模型中显著上调 Scn1a表达并恢复Nav1.1蛋白水平,挽救了DS皮质中间神经元的膜兴奋性和动作电位放电,并显著减轻了DS小鼠中热疗引起的癫痫发作。

Gabriele Lignani最后主要介绍了CRISPR介导的基因调控在局灶性发作性癫痫中的治疗。难治性癫痫常为局灶性,具有猝死、共患忧郁症的高风险,给社会带来了沉重负担。基因治疗不仅适用于遗传性癫痫,也可适用于非遗传性癫痫,因为不同基因、不同区域、不同细胞都可对神经元兴奋性产生影响。利用CRISPRa技术,将dCas9与10个VP16(VP160)结合能够有效促进内源性基因的表达。该技术已在体内外成功进行了KCNA1-Kv1.1的表达上调介导,导致神经元兴奋性大幅下降,减少了颞叶癫痫模型中自发的全身强直阵挛发作,并挽救了与慢性癫痫相关的认知障碍和转录组改变。此外,该技术也能通过同时上调Kcnq2/Kcnq3的表达来形成功能性的Kv7通道,通过同时上调Kcna1和Gabra5可纠正体内外神经元电生理失衡(数据未发表)。综上,局灶发作性癫痫的基因治疗是可行的,基因的联合修饰可能为今后的病人治疗提供了更多可行的方案。

 

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Sharon Chiang首先指出,癫痫网络概念逐渐得到同行的接受,此外,癫痫发作呈动态性的特征在动物和人类的研究中都得到验证。接下来她引入一例病例,介绍癫痫发作动态性的特征:27岁女性,10岁起病,诊断为脑炎。症状表现为难以描述的感觉先兆,无法言语,左侧头面部、口部抽动,每周发作3-4次,成簇,经期加重。间期脑电呈双侧广泛放电,发作期脑电双侧颞叶相互独立的起始;磁共振阴性。曾接受VNS但疗效不佳,最终接受双侧海马RNS治疗。通过长时程脑电监测,发现她的发作呈明显周期性,ECoG记录也证实该患者每次发作的电活动具有不同的演变特征。上述不稳定性对决定手术最佳时机造成阻碍。从技术层面将,不同数学模型对于识别癫痫活动具有各有千秋,没有绝对准确的模型,只有更适合于某一情形的选择。接下来,她介绍了状态空间(state space)和隐马尔可夫模型(Hidden Markov model)在癫痫领域中的应用,并指出机器学习算法可以通过计算吸引子(attractor)的状态,从而鉴别癫痫患者处于发作期还是发作间期,这也是反应性神经电刺激(RNS, response neurostimulation)检测发作的内在原理。她还总结了Sagglo等在eLife上发表的一项成果,通过ECoG数据的动态系统揭示了16种不同的癫痫动态模型(dynamotypes),每个患者可以具备多种动态模型。此外,她指出物钟疗法是目前该领域最受关注的热点之一,即结合癫痫患者的节律性电活动与生物钟之间的关系,制定更精准和个体化的治疗参数。她接着介绍了Schield等于2021年在PNAS上发表成果,通过计算效连接网络,得到了癫痫活动随时间动态演变的可控制性,结果表明,在发作起始阶段施加刺激最容易使癫痫得到控制,为未来的治疗提供了新的理论依据。最终,她提出将癫痫的临床数据与机器学习模型相结合,才能更好地推动人工智能在癫痫诊疗中的创新和应用。

Dang K. Nguyen首先概述了机器学习的概念,接着结合实践,分析了机器学习如何帮助我们更好地开展临床上对癫痫病人的诊疗。具体的议题包括以下几个方面:预测疾病早期和晚期死亡率,检测发作间期痫性放电(IEDs),对头皮脑电图的发作期与间期鉴别,监测和预测癫痫发作。首先,他介绍了预测而早期和晚期死亡率的机器学习模型包括线性回归、支持向量机、高斯朴素贝叶斯、随机森林等。一项Hrabok等2021年发表在epilepsia上的研究共得出30项死亡的风险因素,包括并发症、生活习惯、抗癫痫药类型以及治疗模式等。接着,他指出目前应用于EEG的机器学习算法难以检测到具有以下特征的癫痫发作模式:持续时间短,波幅较低,局灶性癫痫的放电过于局限,高频活动,非节律性波形,伪差。他提出,借助更大量的数据有望解决上述问题。随后,他对常用的一些模型检测癫痫的灵敏度、特异度进行了总结,并提出未来可以尝试通过引入注意机制(attention mechanism),纳入关键节点(key points)以提升模型泛化能力,提高3D卷积神经网络检测癫痫的能力。而后,他又介绍了机器学习预测电线的基本流程包括:预处理、特征提取、数据分割、ANN(人工神经网络)分类、后处理、性能评估。他以机器学习预测癫痫发作为主题,将该领域内里程碑式的科研成果按照时间顺序进行了整理。该领域中有待探索的议题包括:长时间的颅内电生理监测,个体化的发作前时间窗,新的发作前期生物学标记物,刻画复杂脑动力学模型的ANN网络,更实用预测体系,复杂的统计学模型。

Demitre Serletis首先介绍了机器学习的基本理论、不同机器学习概念间相互关联(图216),监督与非监督学习的概念。接着,他简述了机器学习算法在癫痫领域的重要应用,包括手术计划制定、机器人辅助SEEG植入、术前评估与病人筛选、神经调控的参数选择。在模型输入方面,可以选择特殊频段的信号,比如高频震荡(HFO)、间期放电。着重介绍了人工智能辅助外科医生决定手术切除的范围。通过海马的单细胞放电,可以有效鉴别发作期和发作间期的动态特征。另一项纳入10项植入颅内电极患者的研究,将Logistic回归应用于几项特征:5种锁相值(PLV,phase-locking value)、峰值、均值和能量。结果显示,对于术后无癫痫发作的6例患者,算法判别出的SOZ触点有96%位于切除范围内。另一项研究通过HFO,相位-振幅偶联等发作间期特征,有效预测了SOZ和非SOZ内的电极触点。之后,他介绍最新的技术如何辅助SEEG的手术,其中多路径计划算法(multiple trajectory planning, MTP)是目前性能较理想的一项技术手段。他介绍了一项20年前的研究:算法通过对80例患者术前的病史、脑电、影像学以及术后病理学等特征的识别、处理,对预后的预测准确率达到63-98%。随后,他解读了一项综述,该文章总结了不同算法和不同模态数据(影像、脑电)预测癫痫手术结局的性能,平均预测AUC(曲线下面积)达到92.5%,证实了预测疗效的有效性。最后,他指出了机器学习存在一些有待改进的问题:数据的异质性,数据处理和成果发表过程中产生的各种偏倚,机器学习方法学自身的不可知部分(黑箱,black box),伦理学的问题等。

图2. 机器学习相关概念示意图

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David E. Carlson的讲座主要包含两个方面议题:什么是机器学习(ML, machine learning),如何评价机器学习模型的性能。在解释机器学习定义时,他通过示意图和函数介绍了线性预测模型(linear predictive model),展示了梯度下降法(gradient descent)是如何逐步优化模型从而实现更好的预测效果的。同时他提出一些重要问题:在设计过程中要考虑实际应用价值;深度学习(deep learning)虽然性能更好,但结果更易出现过拟合;通常要采取交叉验证的方法,而不是将算法直接用于实践;数据模拟要尽可能地接近真实情况。最后,他推荐了两篇机器学习的综述文章,文献当中包含机器学习的具体方法和关键技术,其中一篇介绍了神经科学领域中机器学习的应用(图317)。

图3. Hold-out试验和out-of-sample模型验证

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Chris Lee-Messer以一张发作起始的头皮脑电图为例,介绍了癫痫检测(seizure detection)的概念,并提出实现这一目标需要解决的难题,比如将人工识别的癫痫发作模式进行量化后教给机器,筛选算法需要的信息。首先,机器学习的传统概念就是算法可以基于过去的数据(输入),形成一套流程,从而在得到新的数据,基于现有流程的计算,推导出新数据得到的结论应该是什么(输出)。以一张图为例,对卷积神经网络的概念做了剖析。总体来讲,卷积神经网络是逐层设计的,每一层的输出作为下一层的输入,变量之间的投射关系是对于下一个相邻层面发生的,最终输出与输入变量之间的关系是非线性的。而后,他介绍了自己实验室的研究者所做的相关工作,继而总结了卷积神经网络相比于过去传统的算法的在性能上的优势(Logistic回归、随机森林等)。我们将脑电图输入到模型中的时候,将脑电图完全视为一张图片而不是一串信号,这显然不合理。那么需要思考,如何优化设计,使数据的信息得到充分运用?非监督的模型的优势在识别无标签的数据,就像打棒球,没有教练展示规范的击球动作和落点,但我们可以通过观看棒球比赛中的动作,不断在脑中形成概念:怎样的击球姿势比上一次更好(模型中一层接一层的迭代)。最后他总结道,卷积性的癫痫探测模型(convolutional seizure detection model)作为一种非监督的模型,是基于几何学特征进行计算的,具有较强的转化价值和良好的应用前景。

Zachary M. Grinspan讲座的重点在于介绍其团队开展的多项临床研究,并面向听众招募一些相关疾病的儿童、青少年受试者,以期待借助更丰富的数据集获得重复性更高成果。他介绍了其团队所关注的10种癫痫综合征,包括LG综合征,痫性痉挛,Dravet综合征等。接着,展示了他们团队建立的数据共享平台,教给我们如何使用检索词查找和上传数据。数据库命名学是很重要的问题,他对于检索方法进行了更详细的解读。他以自己的孩子为例,详细演示了如何填报临床试验的CRF表,这步是困扰很多研究人员的问题,患者填报时可能会因为填报系统操作的不方便而退出。

Dmitry Tchapyjnikov发言的主题为:由代码到临床的转化过程中需考虑的实际问题。首先,他回顾了很多癫痫领域中的人工智能应用,包括颅内和头皮脑电的检测系统:间期放电和癫痫识别、神经调控的相关应用;基于自然语言处理算法的文本处理,如病历资料等;脑影像学—定位致痫灶;视频分析—根据对身体运动的记录预测癫痫发作;癫痫可穿戴监测设备;预测药物有效性和副作用;基因——预测不同基因异常患者对药物的反应;组织学——皮层发育不良的自动标注。他强调了前述讲者都曾提及的一个问题:机器学习技术对我们来讲是一个黑匣子(Black box),因为机器提供的信息有可能与实际问题风马牛不相及,我们对输入、输出的解读必须基于所要研究的问题。总之,针对具体临床问题选择合适的模型十分重要。另外,机器学习模型的适用范围十分重要,不同的病种、同一病种的不同患者,以及不同医疗机构之间的异质性特征,都对结果产生影响。以自然语言处理为例,不同医院的病历系统内的词汇表不一致,对于算法来讲是一件比较困难的事情。最后,他强调拟解决的问题决定了对模型性能的要求,比如新生儿癫痫监测装置,特异性非常重要,因为假阳性会造成很多烦扰;而定位致痫灶的影像学模型,应该强调灵敏度。他希望未来涌现出更加开放的,更便于医生理解和使用的机器学习平台。



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感谢一脉阳光医学影像对本次会议报道大力支持。

 


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